用于递送基因编辑疗法的脂质技术
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近期，Pharma's Almanac 采访并与我们的 Dr Stephen Burgess深入探讨了基因编辑技术正在如何从实验室研究走向临床，这是近来历史上最令人期待的生物制药发展之一。成功开发基因编辑疗法的最大障碍之一是对执行编辑功能的敏感大分子组分的有效递送，而脂质纳米颗粒为应对这些挑战提供了可行的解决方案。 Dr Stephen Burgess作者介绍 Stephen Burgess博士担任Avanti Polar Lipids公司的总经理，是禾大医药健康脂质体和核酸递送技术平台的业务负责人，是实现禾大集团成为全球药物递送技术领导者的美好愿景的支柱力量。在过去的30年里，Stephen Burgess博士与众多研究人员合作开发了新型脂质和脂质配方，解决了一些列技术难题，并改善药物递送效率。在药物递送系统开发、基因治疗、治疗性药物和新型疫苗开发等一系列项目中，Stephen Burgess博士发挥了关键作用。他在脂质合成、脂质生物物理特性和膜动力学方面的专业背景对克服这些项目的挑战起到了重要作用。 |
您是否可以给我们介绍一下CRISPR基因编辑疗法的市场应用潜力？
基因编辑技术通过切割、插入或替换基因组中的基因序列来编辑DNA和RNA序列。迄今为止，已经开发出三种关键技术：锌指核酸内切酶(ZNF)、类转录激活因子效应物核酸酶((TALEN))和成簇规律间隔短回文重复((CRISPR))。1 最初，这种技术主要用于研究目的，旨在确定疾病相关通路中的基因--用来评估基因敲除/封锁的后果，或通过引入功能蛋白的基因逆转表型。然今，许多基因编辑技术新型治疗方法已在临床上取得进展。
第一代CRISPR/Cas9基因编辑技术的开发者为此获得2020年诺贝尔化学奖。CRISPR编辑工具自问世以来，已帮助基因工程技术取得了一系列进展 - 目前一些新技术利用第二代方法，还有些新技术依靠第三代方法，通过技术更迭解决早期技术存在的问题，现在已达到治疗药物所需的精确度和持久性。越来越多的基因编辑疗法正在经历临床前筛选和临床研究，持续积累开发经验并伴随着技术升级，相信未来基因编辑技术将带来治疗药物的改进与突破。
当前诸多深耕于此类技术的企业正在加速项目进程。例如，Verve Therapeutics和Intellia Therapeutics已开始相关的临床试验。许多新兴企业也正步入这一领域，其中很多公司专注于体内疗法。随着基因编辑系统的优化，这些技术系统变得更加精确和高效，将具备解决新型和不同疾病的能力，并且将继续朝着体内治疗的方向发展。
那么，为什么LNP是具有吸引力的递送载体？
目前递送CRISPR基因编辑工具的方法有多种，一般可分为物理、生物或化学方法。2 物理递送方法包括电穿孔、显微注射和声致穿孔。电穿孔可以有效地将Cas9 RNP递送到难以转染的细胞中，包括诱导多功能干细胞。2 但它在体内递送的效率很低，因此大多数应用在体外治疗。显微注射是在显微镜下将CRISPR成分注入细胞，因此注射通量有限。此外，虽然这项技术对递送物质的大小没有限制，但确实需要专门的设备和专业知识，而且主要在胚胎阶段进行治疗，因此并不适合人类治疗方法。声致穿孔技术将超声波与注射相结合，并已应用于一些产品研发中。
生物递送主要包括借助病毒载体和类病毒颗粒进行递送。2 通过病毒载体递送技术，是将CRISPR/Cas9编码序列整合到病毒基因组中，进而将RNP复合物释放到靶标细胞中。1某些病毒载体存在安全问题(如突变、致癌、免疫反应)和包载限制。 由于外泌体(膜结合囊泡)具有生物相容性和低免疫原性特点，是用来递送CRISPR/Cas9的另一种天然替代物，人们对这项技术仍在探索当中。
还可以采用化学方法来实现CRISPR基因编辑工具的递送，包括脂质体、脂质纳米颗粒（LNPs）、聚合物纳米颗粒、金纳米颗粒和其他纳米级解决方案。1,2 LNP的免疫原性很低，在促进递送物质和靶向治疗器官或细胞方面具有更大的灵活性，因此很具吸引力。1,3 此外，还可以与可生物降解的LLNS配合使用，从而减少脂质体的生物毒性。
在最近的一项研究中，研究者开发了一种基于CRISPER-Cas9/sgRNA技术的基因疗法，用于治疗杜氏肌营养不良症（DMD）。这一疗法使用了化学递送方法-LNP，在小鼠模型中实现了安全、重复的骨骼肌注射。4
总的来说，与病毒载体技术相比，LNP可提高体内CRISPR/Cas9成分递送的效率，减少毒性，同时保持达到治疗效果要求的精度。
是否遇到来自包载、效率和精度方面的挑战？
LNP作为CRISPR/Cas9基因编辑成分的递送载体，尽管很具吸引力，但也面临诸多挑战。其中一个就是如何将足量活性成分包载在LNP中。因此，这部分研究的重点是开发能够携带具备更大有效载荷的LNP运载工具。另一个重要挑战是提高LNP的递送效率和精度。在基因编辑方面，需要向大量的细胞递送成分；因此，高效递送对于配制具有成本效益的药物是非常必要的。此外，防止基因编辑脱靶也非常重要。
能否详细介绍下什么是带有脂质包载的聚合物核心的LNP？
混合型LNP可能是一种解决方案。这种LNP有封闭遗传物质的固体聚合物核心和由脂质成分组成的外部脂质包载组成。脂质成分具有生物相容性，更容易穿过细胞的脂质膜，能够高效封闭和保护遗传物质并在细胞间被吸收。即使是非天然的可离子化脂质，通过采用特定的制造方式，也可具有生物相容性和可代谢性，因此不会出现毒性问题。此外，聚合物核心意味着需要更少的脂质材料，从而进一步降低毒性。
此外，有可能将靶向剂-肽、蛋白质或抗体-拴在脂质上，有助于靶向治疗特定区域。因此，关键问题是设计聚合物核心，使其能够封存大的基因编辑成分，同时保持理想的递送效率。成功开发混合LNP聚合物核心将使更多遗传物质有效地、有针对性地递送，同时减少毒性，让聚合物核心设计成为LNP生产的关键性研究和发展领域。
来源：
1. Duan, Li et al. “Nanoparticle Delivery of CRISPR/Cas9 forGenome Editing.” Front. Genet. 12 May 2021.
2. Taha, Eman A., Joseph Lee, and Akitsu Hotta. “Delivery ofCRISPR-Cas tools for in vivo genome editing therapy: Trends andchallenges.” Journal of Controlled Release. 342: 345–361 (2022).
3. Ross, Colin J. D. et al. “Lipid-Nanoparticle-Based Deliveryof CRISPR/Cas9 Genome-Editing Components.” Mol.Pharmaceutics. 19: 1669–1686 2022.
4. Kenjo, Eriya et al. “Low immunogenicity of LNP allowsrepeated administrations of CRISPR-Cas9 mRNA into skeletalmuscle in mice.” Nature Communications. 12: 7101 (2021).
