PD-L1靶向LNP设计：PTEN癌症治疗研究
引言
尽管PD-L1/PD-1阻断抗体通过重新激活耗竭的T细胞来增强免疫反应，但其效果受到肿瘤免疫原性低和免疫抑制性肿瘤微环境的限制。挑战包括在肿瘤内有效基因转导，通常受到效率低下和宿主免疫反应的阻碍。
LNP递送系统在mRNA递送方面的进步已经缓解了对肿瘤抑制基因治疗的担忧，但在实现对癌细胞的靶向传递和最小化非靶向效应方面仍然存在挑战。
通过调节LNP的特性，例如调整PEG化或系统变化脂质成分，可以实现组织特异性的mRNA传递。
今天介绍的这篇论文，采用了一种简化的方法将肿瘤靶向肽整合到LNP中；通过无铜点击反应将程序性死亡配体1（PD-L1）结合肽与PEG化脂质共轭，并直接整合到LNP组成中（Pep LNP）。
为了评估通过恢复肿瘤抑制基因来介导的抗癌免疫疗法，研究通过Pep LNP将编码磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）的mRNA传递到PTEN缺乏的三阴性乳腺癌（TNBCs）中。装载有PTEN mRNA的Pep LNP特别促进了4T1肿瘤中自噬介导的免疫原性细胞死亡，从而产生有效的抗癌免疫反应。本研究突出了肿瘤靶向LNPs在基于mRNA的癌症治疗中的潜力。
结果
1. Pep LNP的物理化学特性
为了将PD-L1结合肽与PEG化脂质共轭，研究采用了创新的无铜点击化学反应，将DSPE-PEG2K-DBCO与N端叠氮化乙酰PD-L1结合D肽（NYSKPTDRQYHF；简称Pep）的偶联，从而合成DSPE-PEG2K-Pep（图2a）。通过优化反应条件，发现在1:1的摩尔比下，反应效率最高。
接着将DSPE-PEG2K-Pep整合入LNP中，形成了Pep LNP，它们在体外实验中显示出与PD-L1蛋白的强烈结合能力。这些LNP在大小和多分散指数上与未修饰的LNP相似，但表面修饰的肽显著提高了靶向性。在0.3摩尔百分比的肽浓度下，获得了最佳的涂层效率。
2. Pep LNP通过PD-L1结合能力增强细胞摄取
实验中，研究人员使用了含有Cy5标记的寡核苷酸DNA和EGFP mRNA的LNP，并将其与His-PD-L1蛋白共孵化。
结果显示，只有经PD-L1靶向肽修饰的Pep LNP在与His-PD-L1蛋白孵育后显示出Cy5信号，表明其成功保留了PD-L1结合能力。此外，与未修饰的Con LNP相比，Pep LNP在PD-L1过表达的CT26.CL25癌细胞中的结合能力显著增强，这一效果可以通过预先用抗PD-L1抗体处理细胞来阻断。进一步的实验也证实了Pep LNP在多种癌细胞系中具有PD-L1依赖性的细胞结合能力。
3. Pep LNP在体内的肿瘤靶向mRNA传递
在验证了Pep LNPs的PD-L1结合能力后，研究者通过CT26.CL25结肠癌和4T1 TNBC荷载的BALB/c小鼠模型评估了其在体内的肿瘤靶向效果。实验中，首先确认了含荧光素酶mRNA的LNP在小鼠血清中的稳定性，然后比较了不同PEG脂质组成的LNP的生物分布，发现添加DSPE-PEG2K并未影响其肿瘤靶向效果。通过静脉注射DiD标记的LNP，观察到Pep LNP在肿瘤中的积累显著高于其他组，且在肿瘤与肝脏/脾脏的辐射效率比率上，Pep LNP也展现出更高的肿瘤靶向性。这些结果证实了Pep LNP通过PD-L1依赖性主动靶向机制在肿瘤组织中的有效积累，为mRNA药物的精准传递提供了有力证据。
4. Pep LNP在PTEN缺乏的癌细胞中诱导自噬
研究中，通过Pep LNP传递PTEN mRNA至四种乳腺癌细胞系，包括PTEN缺失的HCC1937、PTEN缺乏的4T1-Luc以及PTEN完整的BT474和SK-BR-3细胞，成功诱导了抗癌效果。
PTEN/Pep LNP在转染后在所有细胞系中均能表达Flag-PTEN蛋白，特别是在PTEN缺失和缺乏的细胞中，细胞活力显著下降，而对PTEN完整的细胞影响不大。此外，PTEN/Pep LNP处理的细胞显示出AKT和mTOR磷酸化的抑制，以及自噬标记物LC3的表达增加，证实了PTEN mRNA通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路在PTEN缺乏的癌细胞中促进自噬。
5. PTEN/Pep LNPs在TNBC中触发ICD和DC成熟
研究发现，经Pep LNP传递的PTEN mRNA能显著提升细胞表面钙网蛋白（CRT）的暴露，以及促进细胞外ATP和HMGB1的释放，相较于对照组有显著增加。此外，PTEN诱导的DAMPs释放能够促进树突细胞（DCs）的成熟，表现为CD40和CD86标记物表达的增加。使用自噬抑制剂巴菲霉素A1（BafA1）的实验进一步证实了PTEN/Pep LNP通过自噬过程有效诱导ICD，BafA1处理减少了由PTEN/Pep LNP触发的ATP释放，验证了自噬在该过程中的关键作用。这些结果表明，PTEN/Pep LNP通过自噬介导的ICD促进了DAMPs的产生，有助于DCs的成熟，为癌症治疗提供了新的策略。
6. PTEN/Pep LNPs在原位TNBC模型中的抗肿瘤效果和免疫反应
研究评估了PTEN/Pep LNP在小鼠模型中对4T1-Luc TNBC肿瘤的治疗效果。小鼠接受了四次PTEN/Pep LNPs注射，结果表明，与对照组相比，PTEN/Pep LNPs显著降低了肿瘤的生物发光信号、体积和重量。此外，PTEN/Pep LNPs处理的肿瘤组织中PTEN蛋白表达最高，证实了mRNA的成功传递。同时，还观察到PTEN/Pep LNPs诱导了肿瘤细胞自噬和免疫原性细胞死亡（ICD），增加了肿瘤引流淋巴结中成熟树突细胞的数量，并促进了CD8+ T细胞向肿瘤组织的浸润。这些结果表明，PTEN/Pep LNPs通过激活自噬和ICD，有效增强了抗肿瘤免疫反应。在安全性评估方面，PTEN/Pep LNPs处理未引起明显的体重变化或组织学毒性，证实了其作为抗癌疗法的潜力。
7. PTEN/Pep LNP在转移性TNBC模型中的抗肿瘤效果
在三阴性乳腺癌（TNBC）中，由于容易转移，患者的预后通常较差。研究通过尾静脉注射4T1-Luc细胞在小鼠中建立了转移模型，并用PTEN/Pep LNP进行治疗。结果显示，PTEN/Pep LNP能显著减少小鼠肺部的转移，抑制肿瘤生长，并提高生存率。这些发现表明，PTEN/Pep LNP有望成为治疗晚期TNBC的有效策略。
讨论
尽管PD-L1/PD-1阻断抗体在增强免疫反应方面取得了进展，但其在肿瘤免疫原性低和免疫抑制性肿瘤微环境中的效果受限。研究通过Pep LNPs平台传递PTEN mRNA，不仅在体外和体内实验中显示出高效的肿瘤靶向性，还激活了强大的抗肿瘤免疫反应。特别是，在PTEN缺乏的TNBC细胞中，PTEN/Pep LNPs诱导的自噬和ICD显著增强了免疫原性，为开发新的癌症免疫疗法提供了有力的工具。
未来的研究将集中于进一步提高Pep LNPs的特异性和效率，以及探索其在不同医疗领域的新应用，以期为癌症患者带来更有效的治疗选择。
文献中使用的以下产品，均来自Avanti Research™：
1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000 (DMG-PEG2K, #880151)
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[二苯环辛基（聚乙二醇）-2000] (DSPE-PEG2K-DBCO, #880229)
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC, #850365）
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Avanti Research, Croda禾大旗下品牌，在提供高纯度脂质、配方开发和服务方面，无论是在制药、基础研究还是诊断领域，都处于行业领先地位。我们的产品目录涵盖了超过2000种脂质，并且我们还提供定制化的脂质合成和配方开发服务，以满足客户的个性化需求。
Design of PD‐L1‐Targeted Lipid Nanoparticles to Turn on PTEN for Efficient Cancer Therapy - Kim - 2024 - Advanced Science - Wiley Online Library
